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胶乳微球利用中罕见题目及解答
公布日期:2018/12/3      欣赏:6138

问:产品阐明书中给出的胶乳粒径是均匀粒径吗?

答:产品阐明书中给出的胶乳粒径(Diameter)是均匀粒径。

问:怎样选择胶乳微球的粒径?

答:一样平常选择粒径小的胶乳微球,则必要的抗体量就多,精细度和线性绝对较好,而选择粒径大的胶乳微球性,则所需抗体少,精细度和线性绝对较差,绝对于小球,大球的敏捷度较好。

问:一样平常状况下ag九游会所利用的微球的浓度大约是几多?

答:整个测定系统中,微球的浓度约莫在0.01%左右,固然这与试剂自己划定的线性有干系。

问:在利用离心办法偶联乳胶微球,一样平常必要多大的(绝对)向心力[xiàng xīn lì]?

答:必要多大的向心力[xiàng xīn lì]和所利用的乳胶微球有关,一样平常70nm左右的微球大约13000g/min 30min以上,粒径越小所需工夫越长,向心力[xiàng xīn lì]越大。

问:卵白(抗体)与微球偶联前,是不是微球的活化工夫越长,服从越好?

答:羧基微球的活化所需工夫很短,一样平常以10-20分钟为宜,永劫间的活化反而会低落偶联服从。

问:由于抗体不但是FC的氨基酸上有NH2,是不是表现它可以在任何偏向与EDCA活化微球偶联呢?假如是如许,是不是会影响抗体与抗原的特异性反响?

答: 现实确实云云,固然由于抗体的空间折叠方法和FC端疏水性强,因而偶联反响的绝大少数产生在Fc端,反抗体与抗原的联合的影响不大。

问:胶乳微球与抗体偶联后,事先没发明有凝聚,但隔夜后发明有凝聚,这是什么缘故原由?怎样控制和制止?

答:这种状况一样平常是偶联服从低的缘故原由。当系统中卵白不敷或是别的缘故原由,使微球外表在交联后还空出很多反响基团时,这些基团又可以与相连微球上的卵白反响,后果是把球又拉在一同了,以是有收集。可以加一些阻断剂 办理,罕见的是BSA,别的,也可进步微球的交联率。但为什么是过一段工夫后才呈现凝聚呢,这是由于微球偶联上卵白后,互相之间由于携携同种电荷的干系,比力波动(以是能以胶体样存在),只要当偶然互相碰撞,遇上相互的反响基团时才干联合。

3、胶乳的自凝征象怎样控制和制止?

答:胶乳自凝与很多要素有关,如高电解质浓度、外表价电荷被中和、或置于某些倒霉情况如冷冻时。假如电解质浓度降低到某一程度,使得外表的价负荷被遮蔽,胶乳微球之间产生打仗,于是便发生凝聚,故高离子强度的缓冲溶液不该利用,缓冲溶液的的浓度不要凌驾50mM,但有些CML胶乳微球具有高电荷密度,则也可以耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球,不克不及利用阳电荷的缓冲溶液如Tris缓冲溶液,由于能使电荷中和而凝聚。在临时贮藏时,悬浮介质的pH值应至多坚持在比胶乳微球外表基团的pKa值高1-2pH单元。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不波动,故胶乳微球的浓度只管即便以低浓度为宜,胶乳微球也不克不及受冷冻,不然会凝聚。

问:抗体偶联至羧基微球后,即时检测结果很好,但置于37 2天后,抗体活性好像降落很大,什么缘故原由?

答:这种状况大约因此下状况所致:一、乳胶微球含有外表活性剂,招致胶乳本身呈现自凝征象,可以经过显微镜举行察看,假如是胶乳含有活性剂,则在偶联之行进行洗濯,包管偶联的胶乳微球没有收集。二、假如共价联合反响是乐成的而抗体活性失活云云敏捷,最罕见的缘故原由是抗体质量差或试剂过时所致,并且还会呈现一个自在活动白色粉末、继续性团块等,这表标明试剂已被净化。

问:胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保管波动性最好?

答:一样平常常用的是低浓度的Goods缓冲液,如MOPSO、MES、HEPES等缓冲液,浓度在25-50mmol/L。

问:胶乳微球偶联抗体后与抗原举行反响,但反响不分明,是什么缘故原由所致?

答:⑴抗原和抗体不婚配;⑵包被的抗体量下足;⑶抗体利用量虽多,但偶联服从低。

问:怎样选择胶乳试剂的波长?

答:胶乳试剂随着检测波长的增长吸光度低落,为了包管试剂检测历程中不凌驾吸光度的检测限,一样平常胶乳试剂的波长选择在546-600nm左右。

微球外表基团品种及其反响

微球外表基团

活化剂

与之反响之基团

天生化学键范例

羧基

EDC;EDC/(sulfo)NHS;

CDI;CMPI

伯氨;仲氨

酰胺;仲胺

氨基

交联剂

硼氢化氰

羟基琥珀酰亚胺酯;醛基

卤乙酰基;氯甲基酯

酰胺;仲胺或叔胺

酰肼

交联剂

硼氢化氰

羟基琥珀酰亚胺酯

醛基

二酰基肼

复原型腙

环氧基

 

氨基;巯基;羟基

仲胺;硫醚;醚

醛基

硼氢化氰;苯胺

酰肼;肼;氨氧基

腙;腙;肟

巯基

交联剂;四硫磺酸钠

4,4'-联吡啶二硫醚

马来酰亚胺;卤乙酰基;二硫吡啶;;环氧基;羟基琥珀酰亚胺酯;乙烯砜

硫醚;硫醚;二硫化物

二硫化物;硫醚;硫醚

硫醚

羟基

CDI;对甲苯磺酰氯

溴化氰;DSC

双环氧基化合物

氨基;巯基;羟基

胺;仲胺;硫醚;醚

金属基

硫醇或二硫醇

 

 

硅羟基

硅烷

 

 

 

共价联合胶乳微球的参考办法(以下内容均为外洋文献翻译过去的)

A. 一步法

1. 配制50 mM 的MES反响缓冲溶液,pH值为6.0;

2. 将卵白质消融于反响缓冲溶液中,其浓度为10mg/ml;

3. 用反响缓冲溶液浓缩胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);

4. 将上述卵白质溶液与胶乳微球混和,混和后在室温培养20分钟;

5. 用去离子水配制EDAC溶液,浓度为10 mg/ml(52μmol/ml);

6. 取盘算量的EDAC溶液加到卵白质与胶乳微球混淆液中;

7. 用0.1 M氢氧化钠(NaOH)溶液调解该反响混淆液的pH值至 6.5±0.2,在摇床室温培养2小时;

8. 将未联合的卵白质撤除,贮藏于缓冲溶液中。

B. 二步法

复杂二步法

1. 用反响缓冲溶液浓缩胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);

2.1ml胶乳微球悬浮液,参加20 mg EDAC,在室温培养40分钟,在20分钟后第二次参加20 mg/ml;

3.用相称体积的该缓冲溶液来洗濯胶乳微球,离心,用1倍体积的缓冲溶液反复处置;

4.将卵白质消融于50-100mM的MES缓冲溶液中,卵白质浓度为1mg/ml;

5.再将胶乳微球悬浮于去离子水或联合的缓冲溶液中,敏捷参加消融的卵白质,37℃搅拌反响3小时;

6.按1ml反响混淆液参加2.5 μl乙醇胺混淆,搅拌反响10分钟;

7.撤除未联合的卵白质,贮藏与储存的缓冲溶液中。

天生NHS-酯的两头体二步法

1.每ml反响混淆物参加下列各物:

a.去离子水是最初容积为1.0 ml;

b.0.1 ml的10x的储备缓冲溶液,其pH值为6.0-6.5(一样平常可用0.5 M MES缓冲溶液);

胶乳微球终极浓度为1%(W/V);

c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去离子水中的溶液;

d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去离子水中的溶液(注5、6);

2.在室温将此混淆物反响15-30分钟,不停搅拌;

3.用MES缓冲液或纯化水洗濯胶乳微球悬浮物,撤除未反响的NHS和EDAC;

4.重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为1%(w/v);

5.将联合的卵白质溶于50-100mM 的MES缓冲溶液中,浓度为1 mg/ml;

6.立刻参加卵白质溶液(胶乳微球、卵白质弛缓冲溶液的浓度辨别为0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM);

7.将混淆物反响至多2小时,悄悄搅拌;

8. 按1ml反响混淆液参加2.5 μl乙醇胺混淆,搅拌反响10分钟;

9.撤除未联合的卵白质和乙醇胺,贮与相宜的储存缓冲溶液中。

C、卵白质与带醛基的胶乳微球反响

带醛基的胶乳微球是疏水性的胶乳微球,能吸附并能与卵白质在中性pH条件下天生Schiff碱,这是脂肪族醛基与卵白质的氨基产生的反响(赖氨酸的伯胺)。这些胶乳微球不需事前活化而天生共价链。Schiff碱的天生是可逆反响。此Schiff碱能被氰基氢硼化钠(sodium cyanoborohydride)反响复原至波动的烷基胺。当肽类或其他有单一反响氨基的分子与带醛基的胶乳微球联合时,由于复原而趋势波动。

上面阐明卵白质与带醛基的胶乳微球联合的办法:

1. 配制50 mM的反响缓冲溶液,pH值为7.0-7.5;

2. 配制10 mg/ml的卵白质在反响缓冲溶液中的溶液;

3. 配制1%(w/v) 带醛基胶乳微球在反响缓冲溶液中的悬浮液;

4. 将1份卵白质溶液和10份胶乳微球悬浮液混和,在室温反响2小时;

5. 撤除未联合的卵白质;

6. 贮藏胶乳微球结和物与相宜的储存缓冲溶液中。

 
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